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발광 이미징을 이용한 protein-protein interaction visualization에

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서론

발광(bioluminescence) 기법을 이용해서 실험을 해보신 적이 있으시다면, plate-based 실험에서 다양한 생물학적 과정을 확인하는 데 이를 활용해 보셨을 것입니다. 발광 기술은 기존의 형광 기반의 실험에 비해 특히 감도 면에서 더 큰 장점을 제공합니다. 그러나 한 가지 중요한 의문은 남아 있습니다. 이 발광 signal이 과연 개별 세포에서 일어나는 생물학적 현상을 얼마나 정확하게 반영하고 있는 것일까요? ​

세포 간의 signal을 해석하는 기존의 방법들은 복잡하고 시간이 많이 소요되며, 발광을 통해 얻은 결과를 대략적으로 추정하는 데 그쳤습니다. 바로 이 점에서 GloMax® Galaxy Bioluminescence Imager 가 큰 변화를 가져옵니다. 이 새로운 Imager는 단순한 수치 출력을 넘어, 개별 세포 수준에서 일어나는 현상을 밝혀내기 위해 NanoLuc® 기술을 사용해 개별 세포에서 발생하는 단백질 상호 작용을 직접적으로 시각화할 수 있습니다. ​

 NanoLuc® 기술은 복잡한 생물학적 시스템에서 미묘한 단백질 interaction을 감지하는 데 탁월한 tool로 잘 알려져 있습니다. 이 강력한 발광 효소는 형광보다 휠씬 더 넓은 linear range를 제공하며 단백질 interaction과 같은 단백질 활성의 미세한 변화도 더 잘 감지할 수 있게 해줍니다. 기존의 microplate reader는 많은 세포에서 생성되는 signal을 측정하여 생물학적으로 일어나는 현상을 추정하는 방식으로 사용됩니다. 하지만 세포 집단 내에서 발생하는 이러한 발광 값을 실제로 검증하는 것이 그동안 어려운 과제였습니다. 이제 GloMax® Galaxy는 발광 이미징을 통해 단순한 수치를 넘어 단백질 interaction을 직접적으로 시각화할 수 있는 강력한 기능을 제공합니다.

NanoBiT® 기법을 이용한 Protein:Protein Interaction 측정

NanoBiT® 기법을 통해 protein:protein interaction을 측정하는 예를 살펴보겠습니다. NanoBiT은 NanoLuc® luciferase 효소를 두 개의 subunit, 즉 Large BiT (LgBiT)과 Small BiT (SmBiT)로 나누는 방식으로 작동합니다. 이 두 단백질은 서로에 대한 affinity가 낮지만, 서로 근접하게 되면 LgBiT과 SmBiT이 결합하여 luciferase 효소로 재구성되어 발광 값을 생성합니다. 이 non-lytic assay는 실시간으로 protein:protein interaction을 민감하게 정량화할 수 있는 방법을 제공합니다.
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​ 연구자들은 이 기술을 사용하여 G protein-coupled receptor (GPCR)을 연구했습니다. 그들은 세포 독성 효과를 가지는 림프구의 표면 마커로서 매우 선택적인 chemokine receptor인 CX3CR1(Chemokine C-X3-C motif) receptor 1)을 선택했습니다. GPCR이 β-arrestin 2 (ARRB2)과 어떻게 interaction 하는지 이해하면, recruitment을 통해 염증성 질환의 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.
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이 실험에서는 CX3CR1과 SmBiT을 fusion하고 ARRB2와 LgBiT을 fusion한 형태로 안정적으로 발현하는 HEK293 cell을 사용했습니다. 이 세포주는 프로메가의 Early Access 프로그램을 통해 제공됩니다. 연구자들은 CX3CR11 agonist인 Fractalkine를 다양한 농도로 세포에 처리했습니다. Fractalkine 처리 후 β-arrestin 2와 결합하고 recruitment 됩니다. Figure 1에서는 Fractalkine 처리에 따라 dose-dependent하게 NanoBiT® luciferase signal이 증가하는 것을 보여주며, 이는 같은 cell을 사용하여 발표한 이전 연구 결과와 일치합니다.   

Figure 1: Fractalkine 농도에 따른 CX3CR: β-arrestin 2 interaction의 kinetic 결과를 보여줍니다.

이 결과는 매우 유용하지만, CX3CR1이 β-arrestin 2에 결합하면서 receptor internalization을 완전히 나타내지는 않습니다. 발광 이미징을 통해 이 signal이 receptor internalization을 나타내는지 확인했습니다.

발광 이미징을 통해 결과 수치를 이미지로 변환하기

NanoBiT® 기술은 발광 signal을 통해 protein:protein interaction을 확인하는 강력한 방법을 제공합니다. 하지만 이 plate-based assay만으로는 세포 내 단백질 이동이 발광 signal을 생성하고 있는지를 확인하기 어렵습니다. 발광 signal과 internalization을 시각화하기 위해, HEK293 cell을 각 well에 60 ~ 75K 세포를 plating하고 overnight 배양했습니다. 배지를 Opti-MEM으로 교체한 후 세포를 5시간 동안 무혈청 상태로 유지한 뒤, Fractalkine 10nM로 처리했습니다. ​

Figure 2는 GloMax® Galaxy에서 측정된 이미지를 기반으로 한 비디오입니다. 총 캡처 시간은 24분이었으며, 각 이미지는 3분간 노출하여 촬영하였습니다. 비디오의 시작 부분에서는 세포가 보이지 않아, Fractalkine 처리 전에는 발광 signal이 없음을 나타냅니다. 10nM Fractalkine으로 처리한 후 발광 signal이 빠르게 증가하며 이는 CX3CR: β-arrestin 2 interaction을 나타냅니다. 비디오를 자세히 살펴보면 발광 signal이 주로 세포막에서 세포 내 공간으로 이동하여 작은 점처럼 보이는 localization을 확인할 수 있습니다. 이 짧은 시간 동안의 signal 변화는 CX3CR: β-arrestin 2 interaction 후 receptor internalization을 나타냅니다.