서론

Targeted protein degradation (TPD)는 기존에 “Undruggable”로 여겨졌던 타겟들을 조절할 수 있는 가능성을 제공하며, 신약 개발 분야에서 혁신적인 접근법으로 주목받고 있습니다. 단순히 단백질 기능을 억제하는 전통적인 inhibitor와 달리, TPD는 PROTAC과 molecular glue와 같은 small molecule degrader를 활용하여 특정 단백질을 세포 내의 ubiquitin-proteasome 시스템을 통해 분해하도록 유도합니다. 프로메가는 단백질 분해 연구를 지원하기 위한 tool을 제공하는데 선도적인 역할을 하고 있으며, 이를 위해 매년 미국 위스콘신 매디슨에 위치한 본사에서 TPD 심포지엄을 개최하고 있습니다. 자세한 내용은 블로그 에서 확인할 수 있습니다.

생물학적 검증 및 분석법 개발

Small molecule degrader을 이용해 타겟 단백질 수준을 조절하는 연구에서 가장 효과적인 도구 중 하나는 HiBiT epitope tag입니다. HiBiT은 11개의 아미노산으로 구성된 peptide tag로, 단백질 수준을 실시간으로 모니터링할 수 있는 강력하고 민감한 방법을 제공합니다. HiBiT은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 통해 genome에 삽입하여 endogenous 타겟 단백질과 fusion 할 수 있고, 상보적인 LgBiT 단백질과 발광 기질을 사용하여 고감도로 검출할 수 있습니다. 그림 1은 세포 내에서 HiBiT과 LgBiT이 상호작용하여 발광하는 과정을 보여줍니다. GloMax® Galaxy Bioluminescence Imager는 HiBiT의 발광 signal을 측정하여, HiBiT 모델 시스템이 정확한 생물학적 현상을 나타내는지 확인할 수 있습니다. 이 초기 검증 단계는 실험 과정에서 타겟 단백질 분해 특성을 구체적으로 분석하는데 매우 중요합니다. 세포 내에서 LgBiT이 발현되면 발광 기질과의 반응을 통해 생성되는 발광 signal을 정량화하고 시각화하므로 타겟 단백질의 양을 실시간으로 평가할 수 있으며, degradation rate와, Dmax 같은 주요 파라미터를 계산할 수 있습니다. 이러한 데이터는 최적의 성능을 가진 degrader 개발에 필수적인 정보를 제공합니다. 

                                                                         

HiBiT knock-in 세포 모델을 활용해 degrader 평가를 진행할 때, 발광 signal이 예상되는 생물학적 현상을 반영하는지 확인하는 초기 과정은 전통적으로 복잡하고 어려운 작업이었습니다. 현미경 분석은 혼합된 세포 집단 내에서 세포를 특성화하고, 기존 plate reader로 파악하기 어려운 요인에 대한 통찰력을 제공합니다. 이를 통해, 반응하는 세포와 반응하지 않는 세포를 구별하거나, 희귀한 이벤트를 식별하고, 특정 세포 내에서 현상이 발생하는 위치를 파악하는 공간적 해상도를 제공합니다. 가장 일반적으로 사용되는 현미경은 형광 현미경이지만, GloMax® Plate Reader와 같은 발광 측정 장비로 검출되는 발광 signal을 활용하려면 HiBiT knock-in 세포주를 형광 signal을 나타낼 수 있도록 추가로 변형해야 하는 한계가 있습니다. 기존 이미징 장비에서는 발광 signal을 완전히 활용하는 데 어려움이 있었으며, 이와 같은 문제는 분석 과정에서도 유사하게 발생합니다. GloMax® Galaxy Bioluminescence Imager는 HiBiT으로 tagging된 단백질의 분해와 같은 발광 분석을 현미경 수준에서 분석을 가능하게 함으로써, 발광 기반 분석 과정을 더욱 개선합니다. 

이 글에서는 HiBiT-tagged GSPT1의 타겟 단백질 분해를 통해 발광 기반의 분석 과정을 설명합니다. GloMax® Galaxy Bioluminescence Imager는 GSPT1 분해 과정을 실시간으로 시각화하여 시간에 따른 타겟 단백질의 분해를 살아있는 세포에서 분석할 수 있도록 지원합니다. 이러한 발광 기반 workflow는 발광 이미징을 통해 확장 가능하며, TPD 연구 분야에서 보다 정밀한 분석 결과를 제공할 수 있습니다.

GSPT1 타겟 단백질 분해

GSPT1 (G1 to S phase transition 1)은 세포 증식과 생존에 관여하는 translation termination factor로, 백혈병 발병과 연관되어 단백질 분해 연구에서 주목받는 타겟 중 하나입니다2,3. 이를 위해 개발된 molecular glue degrader인 CC-885는 GSPT1의 ubiquitination과 이후 분해 과정을 촉진합니다4. CC-885는 E3 ligase CRBN에 결합하여 표면과 특이성을 변화시키며, 이를 통해 neosubstrate인 GSPT1과의 상호작용을 유도하여 궁극적으로 GSPT1의 분해를 유도합니다. CRBN에 결합한 glue로 인해 발생하는 구조적 변화는 타겟 단백질과의 특이성을 이해하는 데 중요한 요소로 작용합니다. GSPT1을 포함한 on-target 및 off-target 분해는 프로메가의 타겟 단백질 분해 서비스에서 제공하는 neosubstrate panel을 통해 분석할 수 있습니다. ​ GSPT1의 특성이 잘 규명되어 있고 세포 증식에서의 역할이 확립되어 있기 때문에, HiBiT 분석을 사용하여 단백질 분해를 관찰하기에 적합한 타겟로 선택되었습니다. 아래와 같은 방법으로 CRISPR ready-to-use cell line을 이용하여 HiBiT-tagged GSPT1의 분해를 분석하였습니다. ​

• HiBiT-GSPT1 HEK293 cell을 60,000 ~ 75,000 cells/well로 Ibidi 8-well microchamber dish의 각 well에 200µl씩 plating하고 overnight 동안 배양했습니다.
• 발광 signal을 유도하기 위해 Opti-MEM과 1:50 비율로 희석한 2x Nano-Glo® Vivazine® Substrate를 준비한 뒤, 각 well의 배양액 절반을 이 기질로 교체하였습니다.
• 발광 측정 전 세포를 1시간 동안 배양하여 equilibration 시킨 뒤, CC-885를 다양한 농도로 처리하였습니다.
• 발광 signal은 24시간 동안 15분 간격으로 측정했습니다.
•                                                                
  

그림 2에서 볼 수 있듯이, CC-885의 농도가 증가함에 따라 HiBiT-GSPT1 HEK293 cell에서 생성된 발광 signal이 감소하였습니다. 약 100nM 이상의 CC-885를 처리했을 때 발광 signal이 빠르고 일관되게 감소하는 것이 관찰되었습니다.

발광 이미징으로 결과 확인

위에서 볼 수 있듯이, CC-885의 농도가 증가함에 따라 HiBiT-GSPT1 세포에서 발광 signal이 유의미하게 감소하였습니다. 그러나 이러한 발광 signal은 luminometer를 통해 동시에 많은 세포로부터 측정된 signal을 합한 결과임을 인식하는 것이 중요합니다. CC-885가 GSPT1 단백질 수준에 미치는 영향을 더 명확히 이해하기 위해, 특히 단일 세포 수준에서 단백질 분해를 이해하기 위한 명확한 발광 발현 패턴이 필요합니다. 세포 내의 위치와 같은 발현 패턴을 분석하면 단백질 분해 연구에서 얻을 수 있는 통찰력이 크게 향상됩니다. CC-885 처리로 HiBiT-GSPT1 세포에서 유도된 TPD를 확인하기 위해, GloMax® Galaxy Bioluminescence Imager를 사용하여 long-term kinetic 이미징 분석을 수행했습니다. 이 확인 단계는 발광 데이터가 적절하게 수집되었는지, luminometer 측정 값과 일치하는지 검증하기 위해 필수적입니다. 발광 이미징은 세포 내 구획 별 단백질 분해, 세포 집단 내에서 분해가 얼마나 일관성 있게 나타나는지, 세포 간 분해 속도에 대한 더 높은 수준의 이해를 제공합니다. HiBiT-tagged GSPT1의 분해를 유도하기 위해 기존 단계를 진행한 뒤, GloMax® Galaxy Bioluminescence Imager를 사용하여 GSPT1 분해 과정의 이미지를 촬영하기 위해 다음과 같은 추가 단계를 수행했습니다.

• GloMax® Galaxy 내의 Environmental Microchamber는 Stagetop Incubator/Controller를 통해 37℃와 5% CO2 조건을 지속적으로 유지했습니다.
• 100nM CC-885 degrader 또는 DMSO를 처리하기 전 기준 이미지(baseline image)를 수집했습니다.
• 이미지는 3분 exposure time으로 설정하여 5시간 동안 연속적으로 수집하였습니다.

그림 3은 5시간 동안 HiBiT-GSPT1의 분해 과정을 보여주는 영상입니다. CC-885를 처리한 경우 발광 signal이 유의미하게 감소하였습니다(2, 3열 이미지). 이미지에 표시된 세포 전반에 걸쳐 발광 signal의 감소가 일관되게 나타났으며, 이는 세포 집단 내에서 비교적 균일하게 단백질의 분해가 일어났음을 보여줍니다. DMSO를 처리한 경우 발광 signal의 감소가 최소로 일어났으며, 이를 통해 발광 signal의 감소는 molecular glue에 의한 것임을 확인할 수 있습니다. DMSO를 처리한 세포에서 관찰된 약간의 발광 signal 감소는 HiBiT signal이 장시간 이미징 동안 자연적으로 감소한 것을 반영합니다. Brightfield 이미징을 통해 이미지 수집 기간 동안 세포 구조가 비교적 변하지 않음을 보여줍니다. 그러나 CC-885로 처리된 세포의 가장자리에서 약간의 말림(curling) 현상이 관찰되었으며, 이는 세포 사멸이 시작되고 있음을 시사합니다.

GloMax® Galaxy를 활용한 발광 이미징

발광 이미징은 형광 이미징에 비해 여러 가지 장점을 제공하며, 특히 세포내 동적, 기능적 현상 및 타겟 위치 연구에 매우 적합합니다. 형광과 달리 발광은 기질과의 생화학적 반응을 통해 발광 signal이 생성되기 때문에 외부 광원이 필요하지 않습니다. 이러한 특성 덕분에 형광 현미경에서 흔히 문제로 지적되는 phototoxicity 및 photobleaching 현상이 발생하지 않으며, 세포 배양 환경에서 낮은 background 발광으로 인해 높은 signal-to-noise ratio를 제공합니다. ​ GloMax® Galaxy Bioluminescence Imager는 NanoLuc® Luciferase 기술(예: HiBiT)을 활용해 살아있는 세포, 고정된 세포, 조직에서 단백질의 dynamics를 분석할 수 있는 다용도 장비입니다. 이 장비는 발광 현미경, 형광 이미징, brightfield 이미징 기능을 통합하여 세포 내 reference 마커와 세포의 형태를 종합적으로 분석할 수 있도록 디자인되었습니다. 또한, Stagetop Incubator를 장착하면 온도, 습도, 가스를 조절하여 장시간 동안 안정적인 kinetic 이미징이 가능합니다.

결론

이번 연구는 GloMax® Galaxy Bioluminescence Imager를 활용한 단백질 분해의 실시간 이미징으로의 전환을 강조하며 발광 이미징을 통해 TPD workflow를 개선하는 방법을 보여줍니다. 발광 이미징은 기존 형광 이미징에서 흔히 발생하는 어려움을 최소화하면서, signal-to-noise ratio를 높이고 phototoxicity을 줄여 분석 과정을 크게 개선할 수 있습니다. 이 장비는 프로메가가 TPD와 같은 복잡한 생물학적 과정을 분석하기 위해 최근에 출시된 제품입니다. 프로메가는 발광 기술 분야에서 지속적인 혁신을 통해 연구자들이 TPD 연구에서 보다 정확하고 심도 있는 결과를 얻을 수 있도록 지원합니다.

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