암 연구 분야에서 세포 증식을 정확하게 측정하는 것은 치료제의 효능을 평가하는 데 매우 중요합니다. 그러나 CDK 4/6 inhibitor는 G1 phase에서 cell cycle을 정지시키지만 세포 성장은 완전히 억제되지 않기 때문에 cell proliferation을 측정하는 데 어려움이 있을 수 있습니다. 세포가 계속해서 성장함에 따라 미토콘드리아 활성(ATP level), 총 세포 단백질, PRISM molecular barcoding을 통해 측정되는 mRNA 등과 같은 세포 성장과 비례하는 인자에 의존적인 proliferation 분석 결과는 왜곡될 수 있습니다. 이 경우, 세포가 실제로 분열하지 않더라도 측정값의 증가로 인해 활발한 proliferation이 이루어지고 있는 것으로 잘못 해석될 수 있습니다.

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연구자들 사이에서 이러한 문제에 대한 인식이 점점 높아지고 있습니다. 최근 연구에서는 대사 기반 분석법을 사용하여 cell cycle을 정지시키는 약물을 처리한 후 proliferation을 평가한 결과, 실제 세포 상태와 측정된 결과가 일치하지 않는 경우를 보여주며 기존 분석법의 한계를 부각하였습니다. 이 글을 통해 해당 연구가 시사하는 바를 논의하고, Promega의 assay가 이러한 문제를 어떻게 해결할 수 있는지 설명하고자 합니다. 

CDK 4/6 inhibitor는 새로운 proliferation assay의 필요성을 제기합니다.

CDK 4/6 inhibitor의 암 치료 효능을 평가한 최근 연구에서는 기존의 cell proliferation 분석 방법을 재고할 필요성을 강조하고 있습니다(Foy et al., 2024). CDK4/6 inhibitor는 cell cycle을 효과적으로 정지시키지만, 세포 크기의 성장은 지속됩니다. 이로 인해 미토콘드리아의 활성은 증가하고 ATP level이 상승하여, ATP를 세포 수의 간접적인 marker로 사용하는 분석법은 정확한 결과를 도출하기 어렵습니다.

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연구에서 저자들은 CDK 4/6 inhibitor인 palbociclib을 1 µM 농도로 8종류의 암 세포주에 처리한 후, CellTiter-Glo® Assay 및 DNA content 기반 분석법인 CyQuant™을 사용하여 cell proliferation을 평가했습니다. 약물 처리 후 세포는 G1 phase에서 정지되었지만, 세포 크기와 미토콘드리아 양은 증가했습니다. 그 결과 ATP level은 상승했으나, CyQuant™ Direct로 측정된 DNA 양에는 변화가 없었습니다. CellTiter-Glo® Assay는 특히 NCI-60 Screen과 같은 대규모 프로젝트에서 cell health를 평가하는 데 중요한 역할을 하지만, 논문에서 설명한 상황과 같은 경우에는 다른 분석법이 더 적합할 수 있습니다.  

CDK 4/6 inhibitor는 새로운 proliferation assay의 필요성을 제기합니다.

CDK 4/6 inhibitor의 암 치료 효능을 평가한 최근 연구에서는 기존의 cell proliferation 분석 방법을 재고할 필요성을 강조하고 있습니다(Foy et al., 2024). CDK4/6 inhibitor는 cell cycle을 효과적으로 정지시키지만, 세포 크기의 성장은 지속됩니다. 이로 인해 미토콘드리아의 활성은 증가하고 ATP level이 상승하여, ATP를 세포 수의 간접적인 marker로 사용하는 분석법은 정확한 결과를 도출하기 어렵습니다.

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연구에서 저자들은 CDK 4/6 inhibitor인 palbociclib을 1 µM 농도로 8종류의 암 세포주에 처리한 후, CellTiter-Glo® Assay 및 DNA content 기반 분석법인 CyQuant™을 사용하여 cell proliferation을 평가했습니다. 약물 처리 후 세포는 G1 phase에서 정지되었지만, 세포 크기와 미토콘드리아 양은 증가했습니다. 그 결과 ATP level은 상승했으나, CyQuant™ Direct로 측정된 DNA 양에는 변화가 없었습니다. CellTiter-Glo® Assay는 특히 NCI-60 Screen과 같은 대규모 프로젝트에서 cell health를 평가하는 데 중요한 역할을 하지만, 논문에서 설명한 상황과 같은 경우에는 다른 분석법이 더 적합할 수 있습니다. 

Cell proliferation을 위한 새로운 방법의 필요성을 해결하다.

Foy와 동료 연구자들은 대사 기반 분석법을 사용하여 cell proliferation을 평가할 때 발생할 수 있는 문제점을 명확히 제시하였습니다. 기존의 일반적인 분석 기술들은 번거로운 washing 단계가 필요하거나 간접적인 marker, 방사성 물질 및 특수 장비에 의존하는 한계가 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 Promega는 세포 증식의 직접적인 marker인 hKi-67를 측정하기 위한 Lumit® hKi-67 Immunoassay를 개발했습니다. 이 immunoassay는 대사 과정에 영향을 받지 않는 세포 증식 단계에서 잘 알려진 marker를 측정함으로써 신뢰성 높은 결과를 제공합니다. 또한, 빠르고 washing이 필요 없는 ‘add-and-measure’ 방식의 프로토콜을 사용하여 실험 시간을 단축하며, CyQuant™보다 더 빠르게 proliferation 결과를 얻을 수 있습니다(그림 1). 

그림 1. 

HCT 116 cell (10,000 cells/well, 96-well plate)에 anti-proliferative agent인 nutlin-3A를 농도별로 처리한 결과, 세포 독성은 관찰되지 않았으며 Ki-67 발현은 농도가 증가함에 따라 감소했습니다. Ki-67 수준은 Lumit® hKi-67 Immunoassay로 측정하였으며, viable cell의 개수는 parallel assay plate에서 CyQUANT™ Direct로 측정하였습니다.

이 assay는 Lumit® technology를 활용하여 hKi-67가 존재할 때 active NanoBiT® luciferase를 형성하는 labeled primary antibody를 사용합니다. 여기에 기질을 추가하면 Ki-67 발현에 비례하는 발광 신호가 생성됩니다(그림 2). 

그림 2. Lumit® hKi-67 Immunoassay 원리 

 형성하는 labeled primary antibod 결론적으로 대사 기반 분석법은 cell proliferation 보다는 cell growth만을 반영할 수 있기 때문에 새로운 분석법이 필요할 수 있음을 보여줍니다. Promega의 혁신적인 Lumit® hKi-67 Immunoassay for Cell Proliferation은 세포의 대사 상태와 무관한 직접적인 marker를 측정하여, 연구자들이 cell proliferation을 보다 정확하고 신뢰성 있게 평가할 수 있도록 지원합니다. Promega는 연구자들에게 cell health를 이해하는 혁신적인 솔루션을 지속적으로 제공하고 있습니다

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